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病毒定制服務

慢病毒定制化服務

文字:[大][中][小] 手機頁面二維碼 2016/9/14     瀏覽次數:    

慢病毒定制化服務

慢病毒載體的特點和載體介紹

  人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus (HIV, lentivirus) type-1 )載體在實際應用中有較多的優點,比如說它們能感染非分裂期的細胞,整合到基因組中實現長時間的基因表達,滴度比原逆轉錄病毒體系更好, 免疫反應小等優點。 慢病毒載體還具有轉移的基因片段容量較大( 9 kb) ,絕大多數。 由于病毒載體刪除了包裝基因和外殼蛋白后,我們的病毒載體是缺陷型的病毒,它不能在宿主細胞增殖,也不會導致細胞的死亡,被它感染的細胞能夠連續傳代。

 

慢病毒服務項目

1)基因及長鏈非編碼RNA( LncRNA)表達研究

   可滿足CDS長度長達5K的真核基因或LncRNA轉化需求;根據實驗目的需要選擇GFP/mCherry/CFP/YFP/tdTomato/FLAG融合表達并攜帶Puromycin抗性篩選標記。 

  2) RNA干擾和microRNA表達研究

      利用U6或H1啟動子進行小RNA的表達,以實現基因的RNA干擾以及microRNA的表達。可根據實驗目的選擇添加Puromycin抗性/Hygromycin抗性/RFP/GFP標記或者同時采用抗生素和熒光標記。 

3)組織表達特異性及轉錄活性調節研究

     將目的啟動子或作用元件與Luc/GFP/CFP/LacZ連接,在組織或細胞水平進行表達活性和轉錄因子調節效率檢測。 

  4) IPS構建制備研究

     利用已構建的人、大鼠和小鼠OCT4, SOX2, Klf4和c-Myc過表達慢病毒,共感染目的細胞,進行IPS的構建和制備。

 

慢病毒顆粒生產包裝步驟

  第一步: 是把外源基因克隆進合適的載體。 大多數情況下,外源基因被克隆到一個包含 LTR/MCS 的載體中( pLOV.CMV.GFP 或類似載體,以下的說明中以 pLOV.CMV.GFP 為例)。這些載體中長末端重復( LTR)序列, psi 序列, RRE 序列, cppt 序列是包裝必須的順式作用元件。

第二步: 重組表達質粒同 psPAX2 包裝質粒和 pMD2.G(外膜質粒)共轉染進 293T 細胞。 轉染 2 到 3 天后重組病毒顆粒在包裝細胞中組裝完成,并分泌到培養基上清中。 

第三步: 回收培養上清,并用離心將細胞碎片除去,再用 0.45μM 的濾膜過濾,準備用于濃縮。 

第四步: 用超速離心機 100000g (約為 30000 轉) 離心 2 小時,去掉上清。沉淀用 200μl DMEM 或 Opti-MEME(invitrogen)溶解。
  第五步: 將得到的病毒用 0.22μM 孔徑的濾膜過濾,除去大的顆粒雜質,分裝后保存于-80℃。
  第六步:用得到的濃縮病毒感染 293T 細胞, 2 天后收集細胞抽提基因組 DNA。 在這個過程中病毒進入細胞,逆轉錄為 DNA 并插入到了基因組 DNA 上。 

  第七步:用定量 PCR 法測定該基因組中病毒的整合頻率,通過這個比例以及原初細胞數和加入的病毒體積可以計算得到病毒的感染滴度。因為只有當病毒具有感染能力時,才能被這種方法檢測到,所以這種方法檢測的滴度單位是( TU/ml)。

 

濃縮純化慢病毒

產品名稱

病毒滴度

總量

贈送陰性對照病毒規格

過表達慢病毒

>10^8 TU/ml

1ml

1ml(>10^8 PFU/ml)

干擾慢病毒

>10^8 TU/ml

1ml

1ml(>10^8 PFU/ml)

 

體外慢病毒

產品名稱

病毒滴度

總量

贈送陰性對照病毒規格

過表達慢病毒

1*10^6~2*10^7TU/ml

10^8 TU

10^8 TU

干擾慢病毒

1*10^6~2*10^7TU/ml

10^8 TU

10^8 TU

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