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病毒定制服務

腺相關病毒定制化服務

文字:[大][中][小] 手機頁面二維碼 2016/9/14     瀏覽次數:    

腺相關病毒定制化服務

 

腺相關病毒載體概述

  腺相關病毒(AAV)是一種復制缺陷型細小病毒,其增殖復制需要腺病毒或皰疹病毒的輔助。AAV無輔助病毒系統(AAV Helper-Free System)可以在無輔助病毒的條件下生產出重組人腺相關病毒。這種系統利用已經明確與調節AAV復制和表達的腺病毒基因產物,并且將這些基因產物通過轉染引進宿主細胞。在AAV Helper-Free System中,生產具感染性的AAV病毒顆粒所需的腺病毒基因產物(例如:E2A,E4和VA RNA 基因)大部分由與其他質粒共轉染進細胞的pHelper質粒提供,其余的腺病毒基因產物由穩定表達腺病毒E1基因的AAV-293宿主細胞提供。AAV-293細胞是經過改良HEK293腺相關病毒生產能力而衍生出的亞克隆細胞系。由于不再需要活的輔助病毒,AAV Helper-Free System提供一個更安全,更便利的替代逆轉錄病毒和腺病毒的基因傳遞系統。

 

腺相關病毒用于基因傳遞和表達的優勢

1) 宿主細胞范圍廣

  腺相關病毒可以感染廣泛的哺乳動物細胞并且以成功應用于人源和非人源蛋白的表達,宿主細胞活躍的分裂不是感染的必要條件,重組腺相關病毒能感染分裂期和非分裂期細胞。

2) 長期的基因表達能力

  重組AAV能保存于人類宿主細胞中,保持長期的基因轉錄表達能力,對于終末分化的細胞這個優點特別明顯。

3) 低免疫原性

  與已獲得臨床應用的腺病毒載體相比,AAV在注射后引起的免疫反應是微弱并且短暫的。

4) 良好的擴散性能

  AAV的病毒粒徑只有腺病毒的1/5,慢病毒的1/4,體積上相差數十倍到100倍,所以AAV的擴散性遠高于這兩種病毒。

5) 較高的生物安全級別

  AAV是天然缺陷型病毒(生產性感染依賴于幾個額外的反式因子),并且目前還沒有發現它和任何的人類疾病有關聯。在AAV Helper-Free System中,AAV反向重復(ITR)序列和rep/cap基因分別位于缺少共同序列的單獨的質粒上,以阻止生產出重組野生型病毒。這樣特征賦予了作為病毒來源的基因傳遞和表達系統的AAV Helper-Free System一個較高的生物安全級別。

 

腺相關病毒顆粒生產包裝

  生產流程示意圖

 

 

實驗步驟

第一步:是把外源基因克隆進合適的載體。 大多數情況下,外源基因被克隆到一個包含ITR/MCS的載體中(pAOV.SYN.GFP或類似載體,以下的說明中以pAOV.SYN.GFP為例)。這些載體中反向末端重復(ITR)序列提供所有AAV復制和包裝必須的順式作用元件。

第二步:重組表達質粒同pHelper(攜帶腺病毒來源的基因)和pAAV-RC(攜帶AAV復制和衣殼基因)共轉染進AAV-293細胞(提供AAV復制和包裝所需的反式作用因子)。轉染2到3天后重組AAV在包裝細胞中組裝完成。

第三步:從被感染AAV-293細胞中收集AAV病毒顆粒,一般AAV顆粒會富集在包裝細胞中,所以收集細胞而后裂解釋放AAV顆粒到上清中可以回收大部分的AAV顆粒。這一步得到的病毒上清液隨后用于感染各種哺乳動物類細胞系的感染實驗。同時上清中的病毒也可以濃縮保留。

第四步:濃縮并純化第三步的病毒上清液,原上清液里面包含了許多細胞蛋白分子和碎片,通過2次CsCl密度梯度離心和1次超濾可以去除絕大部分的細胞蛋白和殘留的CsCl離子。動物實驗都需要純化后的病毒才能夠進行,否則會達不到所需劑量并引起副作用。感染宿主細胞后,基因表達前,單鏈病毒必須變成雙鏈病毒。這個轉變是重組基因表達的限制步驟,可以通過腺病毒雙重感染或依托泊苷(喜樹堿或丁酸鈉)來加速。然而,加速基因表達的試劑對目標細胞是有毒的,如果殘留到細胞上會殺死目標細胞。因此依托泊苷只能短期使用或為了提高病毒滴度時使用。

  第五步:用定量PCR法測定所得到病毒的滴度,這種方法可以得到被包裝到顆粒中的AAV基因組的物理滴度值。AAV的感染滴度值因為感染細胞、AAV外殼蛋白和測試條件不同有很大差異,并且體外的實驗數據不能反映體內的感染情況,所以在比較AAV時,定量PCR得到的物理滴度值是一個更客觀的數值。

 

腺相關病毒

產品名稱

病毒滴度

規格

 贈送陰性對照病毒規格

過表達腺相關病毒

1*10^13TU/ml

100ul

 

shRNA干擾腺相關病毒

1*10^13 TU/ml

100ul


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